根据美国癌症学会官方期刊发表的《2020年全球癌症统计数据》报告显示，肝癌发生率高居恶性肿瘤第六位，是导致癌症相关死亡的第三大疾病。我国仍是全球肝癌年发病人数和死亡人数最多的国家。世界卫生组织调查显示，我国每年新增肝癌病例41万，约占全球45%，并有39万人死于肝癌，5年生存率仅为10-12%。诱导肝癌发生的相关因素特别多，诸如：病毒，化学致癌物，酒精等，但其确切的发病机制目前尚不清楚。因此，建立与人类肝癌生物学特性相近的动物模型，对于肝癌发病机制的研究以及药物开发具有重要的现实意义。
由于不同病因会引发不同基因的改变，导致肝癌具有异质性，因此肝癌模型不具有普遍性。而今天，小编将为大家介绍肝癌相关的小鼠模型，并总结了部分肝癌模型建立方法及相关问题解答供广大研究者进行参考。
一、常见的肝癌模型
1. 诱发性肝癌模型：许多化学致癌剂达到足够的剂量及时间可诱发动物形成肿瘤。常用的 肝癌诱导剂包括：二乙基亚硝胺（DEN）、黄曲霉素B1(AFB1)、四氯化碳（CCl4）等。
优点：可以模拟肿瘤发生的3个过程，即损伤，硬化和肿瘤。
缺点：诱导周期长，致死率高，个体间肝癌发生的时间，部位及病灶数等不均一。
2. 移植性肝癌模型：
-异位移植（即皮下成瘤）
优点：成瘤率高，周期短，肿瘤的大小和位置较易控制，个体差异小，另外，对宿主的影响类似，易于客观判断疗效。
缺点：缺乏肿瘤微环境的影响，该模型不能很准确模拟肿瘤细胞在体内生长。
-原位移植（肝脏，经脾脏）
优点： 原位生长能更好的模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，药物疗效预测更加精准。
缺点： 外科移植手术程序复杂且价格昂贵，另外，难于快速检测肿瘤生长及其对药物的反应。
3. 基因敲除鼠（如HBV-TG, PTEN, APC, miR-122肝特异性敲除, Myc肝特异性过表达）
优点：基因工程肝癌小鼠是肝癌领域非常重要的研究工具，为肝癌发病机制的探索、药 物筛选和临床医学研究提供理想的实验模型。
缺点：技术门槛高，普通实验室较难实施。
部分肝癌模型，上图为肝脏解剖图，下图为病理图。
（a. DEN诱发的肝癌; b. DEN+CCl4诱发的肝癌；c.Mdr2肝特异性敲除引发的肝癌；d.Tak1肝特异性敲除引发的肝癌; e. Pten肝特异性敲除引发的肝癌; f. 原位注射肿瘤细胞引发的肝癌。）
二、部分肝癌模型建立方法介绍
1. 诱发性肝癌模型
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DEN
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剂量 （腹腔注射） |
小鼠品系 |
年龄 |
造模时间 （#成瘤#所有小鼠） |
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20mg/kg DEN |
C57BL-雄 |
12天 |
8-8.5月 |
|
20mg/kg DEN |
C57BL-雌 |
12天 |
9-10月 |
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DEN+CCl4
20mg/kg DEN腹腔注射12日龄C57BL小鼠；达四周龄时. 20% of CCL4 (稀释于橄榄油中) 以1 uL/g剂量腹腔注射，每周一次, 持续约14-18周。
2. 移植性肝癌模型
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皮下成瘤subcutaneous tumor formation
注意点
（1） 肿瘤细胞系选择
（2） 小鼠品系选择：Nude, NOD/SCID, NSG
（3） 接种部位：腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部（血管丰富且易操作部位）
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造模方法
（1） 肿瘤细胞的传代扩增
确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态
（病毒感染可选择再传代扩增；若siRNA或质粒转染处理细胞不建议传代扩增，质粒转染24小时，保证最大效率。siRNA取决于平时做实验的经验。）
（2）计算细胞接种量
结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到1000万/0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）。并且提前计算确定细胞数量，一般注射40只小鼠，至少需要准备50只小鼠的细胞量。
（3）准备裸鼠
一般选择5-6W裸鼠，小于4W动物可能不耐受而过早死亡，大于6W免疫力会增强，不易成瘤；雌雄均可
（4）操作步骤
① 预准备：matrigel 4℃过夜融化，若1人操作可选择使用呼吸麻醉仪，去鼠房前可考虑打一盒冰和带上移液器和枪头，用注射器不好重悬细胞
② 接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置（实验室选择以后腿股）；
③ 向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；
④ 针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为100-200μL（PBS或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤），可看见明显的鼓包；
⑤ 接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；
⑥ 注射完毕后，缓慢旋转退出针头（Z字型扭），尽量避免漏液；
⑦ 细胞需要一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。
（5）后续实验安排
① 分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，低剂量、中剂量及高剂量药物组等；
② 数量：荷瘤时每组不少于10只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取6个有效数据；
③ 给药时间：一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；
④ 人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。
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经脾脏注射肝癌细胞Intrasplenic inoculation
操作步骤：
预准备：麻醉剂2%戊巴比妥钠配置(100ml 0.9%的生理盐水中含有2g戊巴比妥钠，用0.22um 过滤器除菌)。加热垫、止血钳、prolene线
① 腹腔注射麻醉剂（剂量、/kg，如小鼠体重20g，注射100ul））
② 将麻醉状态的小鼠侧躺（我们的左侧），有毛的老鼠需剃毛。在前肢与后肢中线靠后肢1/3处，用75%酒精棉擦拭，观察到暗色的脾脏。
③ 左手用弯头镊提起皮肤，右手操作眼科剪（弯头朝内）剪开小鼠的皮肤，再用镊子提起皮肤下的肌肉组织，剪开，此时观察到鲜红色的脾脏，用镊子轻轻将脾脏提出，靠近下缘2mm位置，针面朝上，慢慢推入的已备好剂量的细胞，可见脾脏被膜肿胀，颜色变稍白。
④ 脾脏下缘和上缘各有一条血管，中间无组织粘连，此时左手用镊子夹住这个没有血管和组织的脾脏，轻轻提起，能明显观察到血管，然后用电凝笔，靠近脾脏将连接的血管和有些许胰腺功能的组织切割下来，观察切割下来的组织血管是否出血（最好用电凝笔再止血）当电凝笔不能止血时，立刻用止血钳夹住出血位置，在贴近止血钳下方用缝合线结扎止血（剪线时留，小于2mm线头）。用镊子轻轻将脾脏稍微往外拉出，观察到上缘的血管，同下缘脾脏血管操作。
⑤ 用镊子提起肌肉组织，此时胰腺较容易重回腹腔。左手用镊子夹住肌肉和皮肤，右手拿缝合针（用离持针器前2mm位置夹住缝合针）穿过一侧皮肤和肌肉，在将另一侧的肌肉和皮肉夹起，缝合针穿透时，打开持针器，左手的镊子顺着针的弧度将针拔出（右手的持针器可辅助稳定老鼠）。靠左4-0#丝线绕靠右的持针器一圈，持针器夹住另一端线头，打结。同操作打第二个结，剪线。用浸有生理盐水的棉花，擦拭伤口周围血渍。
⑥ 将小鼠趴卧，再用拇指和食指捏住小鼠颈部皮肤，并轻提，右手持注射器将针头插到皮下，注射1ml生理盐水（防止脱水）。如果注射后出现皮肤起包，则注射到了皮内。（一般情况下，两个手指可以感觉到针头的位置，可以确定针头是否在皮下）。
⑦ 将脾脏注射后的小鼠放置在加温垫的鼠盒上，以维持其体温。
⑧ 注射后第二天观察小鼠的行为活动，生命体征。
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肝脏原位注射肝癌细胞Intrahepatic transplantation
操作步骤
① 用50%基质胶重悬细胞，小鼠（选用Nude mice）106个/20-30ul PBS体系
② 麻醉小鼠：戊巴比妥钠，麻醉后绑定（可用医用胶布）
③ 剃毛后沿腹中线切开皮肤，长度3cm左右，露出剑状软骨，将切口撑开
④ 先用棉签使用生理盐水浸润，然后将肝左叶（最大的一叶）用棉签挑起
⑤ 缓慢注射20ul细胞悬液，注射后停留5s，旋转退出针头，避免细胞回流。注射成功后在肝脏部位一般能看见白色突起
⑥ 注射完毕后消毒腹腔，然后缝合伤口
（参考资料：Nat Protoc. 2015 Aug;10(8):1264-74.）
实验中相关问题和解答
Related questions and answers
1.如果是质粒或siRNA处理细胞去做皮下成瘤，一般细胞处理多久呢？会取一部分再做个鉴定吗，比如有没有过表达或者敲减？
解 答：留一部分细胞做检验，质粒转染24小时，保证最大效率。siRNA取决于平时做实验的经验，若24h有效果即可收细胞皮下注射。病毒加足够量确保过表达或敲减，可以再细胞传代的。
2. 选择皮下成瘤的细胞系？
解 答：常见HepG2SMMC-7721Huh7Hep3BHCCLM3。不推荐HepG2，需要剂量太大且细胞堆叠生长。
3. 皮下注射、肝脏原位注射、脾脏注射产生的肿瘤有什么区别？该怎样判断应该选择哪一种注射方式进行实验？
解 答：皮下成瘤的优点：成瘤率高，周期短，肿瘤的大小和位置较易控制，个体差异小，另外，对宿主的影响类似，易于客观判断疗效。缺点：缺乏肿瘤微环境的影响，该模型不能很准确模拟肿瘤细胞在体内生长。
原位移植（经脾脏或肝脏原位注射）的优点：原位生长能更好的模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，药物疗效预测更加精准。缺点：外科移植手术程序复杂且价格昂贵，另外，难于快速检测肿瘤生长及其对药物的反应。4. 体外成瘤和体内成瘤的细胞系有特殊明显的差异吗？对体内或者皮下成瘤的小鼠在细胞系的选择上有什么要求？
解 答：关于皮下成瘤，反应细胞恶性表型主要是增殖和干性，HLE不成瘤很大一个原因是它悬浮小球能力就不好，无法聚成块。原位注射主要反应这个细胞在某种微环境中汲取营养和自我适应的能力。这些都需要考虑细胞系在体外实验中如增殖、转移等能力。
使用动物模型是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段，在医学研究方面具有非常重要的意义。成功建立疾病模型是进行体内研究的重要前提，希望本次分享能给大家在肝癌造模方面带来有用的启示。
